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北京显微镜细说奥林巴斯显微镜的照明
点击次数:1061 发布时间:2013-01-09

 

   在很多情况下,一台设计精良的显微镜并不一定会获得良好的成像质量。其主要原因多半是光源未调校好,使标本不能获得充分的照明所至。显微镜标本zui佳的照明状态应该是明亮、无眩光、而且视场照度是均匀的。
    对常规的目视观察及显微摄影,有很多种照明的光源。由于价格低廉,使用寿命长,50W或者100W的卤钨灯是zui常见的一种。在图1的显微镜图的底座中,画出了这种光源。在图中也详细描述了典型的现代透射光显微镜的光路。在此图中,卤钨灯发出3200K的连续光谱(电压为9V时)。此光线通过集光镜和视场镜然后反射到载物台下聚光镜,再到达标本。成像光束由显微镜物镜捕获后到达目镜或者由分光镜分光导入到一个或者几个摄影接口。当灯源发出的光线照明标本并到达目镜或附加的照相机的过程中,光线要经过若干透镜和光栏。在现代显微镜中,要获得zui佳的照明状态,应该对显微镜的光学器件进行校正,使其符合“柯拉照明”的原则。怎样将透射光和反射光显微镜校正到符合柯拉照明的细节我们将在显微镜的《透射光》及《反射光》中进行讨论。图1所示的光路为典型的透射光光路,光路中有一些透镜、光栏、反射镜和分光镜。这些器件引导光线穿过整个显微镜。
卤钨灯在光谱中心为3200K(电源大约为9V时)的状态下工作,但需要采用色转换滤片提升色温进行日光均衡。另外常用的一种光源为75W或者150W氙灯,这种灯有非常高的亮度和很长的寿命,相应的平均输出与人眼的光谱一致,色温与日光型胶卷的要求近似。如果要求非常高的亮度,可以采用锡卤化物灯。在荧光显微镜中,常常采用了解100W或者200W的汞灯。在早一些时候,也采用过碳弧灯或锆灯,但现在很少见。
 在反射光显微镜中,光路系统中照明光源的调整也是十分重要的,特别是金相、半导体晶片检查及新型的荧光显微镜。反射光显微镜也采用多种照明光源(如前面已讨论),也可采用柯拉照明的方式调整到zui佳期的状态。详细的讨论在Kohler illumination for reflected light microscopy中有阐述。反射光显微镜的照明光路即为interactive Java tutorials 的标题,也包括下面的一个连接。
     在"Photography Through the Microscope"一书中,John Delly认为,提供给学术讨论、展览会和科技出版物的显微摄影照片,有80%到90%光路校正均不正确,其标本的照明状况很差。这是显微观察和显微摄影中存在的一个十分严重的通病。通过对许多大学实验室教学显微镜的随机检查,发现聚光镜及光源调整不正确的状况十分明显。我们认为,聚光镜和视场光栏不正确的调校,是产生显微摄影照片缺陷的zui大的原因。
    正确照明的必要性未能受到特别的关注。一台校未经正确校正,价值25,000美圆的显微镜的成像水平可能与手持式放大镜差不多,拍摄影的照片还不及一台校正到柯拉照明zui佳状态的,价值2000美圆的显微镜。本网页的相关部份介绍了有关柯拉照明的理论,并用图形对实施方法进行了解释(透射光和反射光显微镜)。本网页也采用了各种interactive Java tutorials帮助学生掌握这些重要的概念。
    无焦点及非聚焦照明:在一个照明系统中,如果照明光源没有在光路中的任意位置上形成像点,这样的系统称之为无焦点或非聚焦照明系统。在电灯泡未发明之前,显微镜工作者只以选择他们可以选择的光源作为显微镜的照明源。在有日光的时候,使用者可将显微镜对准天空(或使用载物台下反光镜),利用云层作为天然的散射屏使视场中的照度均匀。在显微镜上还设置了一个凹面反射镜,使照明标本的光线更亮一些。白云和蓝天不是光源,它们在在显微镜光路中成像,因此属于无焦点源或非聚集光源。当显微镜在室内或晚间使用时,迫使人们使用人造光源。由于这类光源自身的色温较低,使显微镜标本呈现出的颜及色调与自然光照明下有较大的差异,在使用中往往加入各种蓝色的滤光片进行补偿,使其与自然光照明条件下的色调一致。由于此类照明方式的光源均未在显微镜的光路中成像,这些照明均归类为无焦点或非聚焦照明光源。早期的研究证实,倘若物镜的zui后一片镜片被光源充满,无论是自然光源或人造光源,其光学特性和分辨率并没有多大的差异。后来,科学家们发现一个十分重要的条件:显微镜照明系统的数值孔径应尽量与物镜的数值孔径相同。在19世纪,发明了一种新的“光源聚焦”照明方法(临界照明或称之为Nelsonian照明),使显微镜的照明条件得到改善。
    临界(或纳尔逊)照明:这种照明方法是由英国显微镜工作者爱德华纳尔逊根据阿贝提出的光学原理发明的。从19世纪到20世纪,临界照明在显微镜中得到了十分有效的应用。至今,在那些只使用外部光源或者不需要显微镜摄影的较为价廉的显微镜中仍然提倡使用。
    纳尔逊照明依靠载物台下聚光镜将油灯燃烧的亮度均匀的火焰(或其它亮度均匀的光源)成像于标本平面上,使视场的亮度比较均匀。在这种照明方法中,光源的均匀性是一个十分重要的条件。灯源燃烧产生火焰的亮度应相对的均匀,但是其它的光源,例如放大机上的磨砂灯泡、乳白色灯泡或有带状灯丝的电灯泡均可在临界照明中应用。图2所示为临界照明的光路图,它利用一个假设的油灯提供一个均匀的光源。
    从油灯的火焰发出的光由聚光镜汇聚(参见图2),火焰的像成于载玻片上的标本平面上。实际上,往往成像不可能在火焰的中心上,通常需要重新调整载物台下的反光镜使火焰成像于视场中心,使火焰能充满整个视场。进入显微镜的总光量可由通常加在外部的视场光栏(如果有的话)来控制。应有充够的光线进入显微镜并充满物镜的后焦平面,可适当地调整聚光镜的孔径光栏来达到此目的。成像于焦平面上的光源不很稳定,可能存在一些不均匀的斑点及纹路。可采取稍稍调整一点聚光镜使其产生一点离焦,使视场更均匀来克服这个缺点。有很多场合,更有效的柯拉照明方法取代了纳尔逊照明法。
柯拉照明:本题目将在本的相关章节中作进一步的讨论,本文只对它的概貌作一简明的介绍。在柯拉照明中,光源应成像于聚光镜的孔径光栏处,并通过孔径光栏产生一束平行光照明标本。一个放大的光源像成于聚光镜的下面(孔径光栏处),通过聚光镜产生一个角度很大的能产生标本zui佳分辨率光锥。聚光镜孔径光栏的尺寸可用来控制照明标本光锥的数值孔径,这样可以扼制不必要的杂散光和眩光。这样聚光镜表面的灰尘及玻璃表面的缺陷对视场影响会降至zui小。
在显微镜中,光学器件调校的正确与否,将直接影响有效的标本照明,这些校正包括光源的校正。一个认真的显微镜工作者能熟练的对这些器件进行校正,并能针对标本的差异和物镜的不同进行实践。不正确的校正将严重地影响显微镜摄影照片的质量,使其产生斑点、虚光、色斑、衬度不良及其它各式各样的缺陷。一些zui新的显微镜配置了“预调中”灯泡不需要对灯泡进行调中,有一些显微镜甚至配置了横向不能调整的聚光镜。这类显微镜在出厂时已作了调整,在使用时不需作过多的调整。要使显微镜的照明处于zui佳的状态,在使用前应仔细阅读产品的使用说明书或向厂家的技术代表仔细询问相关的细节。
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